Expresión heteróloga de la lipasa lipa de serratia marcescens (pdb:2qua) en escherichia coli bl21 (de3): uso de extractos crudos para la transesterificación enzimática del aceite de palma africana con etanol (biodiesel) - Barraza Gomez, Jefferson Yadir (Universidad Industrial de Santander, 2016)
La transesterificación mediada por lipasas es una alternativa en permanente exploración, ya que intenta resolver las problemáticas de la producción química de biodiésel. A pesar de las grandes ventajas que ofrecen las lipasas en la industria biotecnológica, su uso a gran escala se ha visto limitado e incluso desestimado, debido a los altos costos de adquisición en el mercado internacional. A nivel nacional, este problema podría solucionarse con la producción local de lipasas. En el presente Trabajo de Grado, se llevó a cabo la expresión recombinante de la lipasa LipA de Serratia marcescens en Escherichia coli BL21 (DE3) con el fin de demostrar la capacidad de la enzima para catalizar la transesterificación del aceite de palma crudo, utilizando etanol como aceptor acilo. En una primera etapa, se clonó el gen sintético LipA (basado en el código PDB: 2QUA) en el vector pET-21d y se indujo la expresión con IPTG. Se estableció que el tiempo más favorable para la extracción de LipA recombinante era de 3 h después de la inducción. En conformidad con la literatura científica, se encontró que LipA forma agregados hidrofóbicos en forma de cuerpos de inclusión. En consecuencia, se identificaron las condiciones más adecuadas para la reconstitución de la lipasa recombinante, a saber, sonicación directa, 1.6 M urea y 8 mM CaCl2. En la segunda etapa se determinaron las mejores condiciones de transesterificación haciendo uso de un diseño experimental de superficie de respuesta. Los resultados evidenciaron la capacidad aciltransferasa de LipA y el fuerte potencial de esta lipasa en la producción de biodiésel, obteniéndose un porcentaje molar de 46.5% FAEE, con una relación molar 9:1 EtOH: aceite, una carga enzimática de 10 U/g de aceite, pH 8 y temperatura ambiente en un sistema sin solvente.
Lipa, Lipase, Serratia Marcescens, Transesterification, Palm Oil, Biodiesel (Faee), Nmr-1H.
Keywords: Lipa; Lipasa; Serratia Marcescens; Transesterificación; Aceite De Palma; Biodiésel (Faee); 1H-Rmn.; Lipase-mediated transesterification is an alternative in permanent exploration; since it could solve the problems of the chemical production of biodiesel. In spite of the great advantages offered by lipases in the biotechnology industry; its utilization on a large scale has been limited and even dismissed; due to the high acquisition costs in the international market. At the national level; this problem could be solved with the local production of lipases. In the present work; the recombinant expression of LipA lipase from Serratia marcescens was carried out on Escherichia coli BL21 (DE3) in order to demonstrate the ability of the enzyme to catalyze the transesterification of crude palm oil using ethanol as acyl acceptor. In a first step; the synthetic LipA gene (based on the PDB ID: 2QUA) was cloned into the pET-21d vector and the expression was induced with IPTG. It was established that the most favorable time for extraction of recombinant LipA was 3 h after induction. According to the scientific literature; it was found that LipA forms hydrophobic aggregates in the form of inclusion bodies. Accordingly; the most suitable conditions for recombinant lipase reconstitution were identified; namely direct sonication; 1.6 M urea and 8 mM CaCl2. In the second stage; the best transesterification conditions were determined using an experimental surface response design. Results evidenced acyltransferase ability of LipA and the strong potential of this lipase in biodiesel production; by obtaining a molar percentage of 46.5% FAEE; with the molar ratio 9:1 of EtOH: oil; enzyme loading of 10 U/g of oil; pH 8 and room temperature in a solvent free system.