Identificación de bacterias del carbón mediante análisis de secuencias del gen ribosomal 16s - Pedraza Leguizamo, Edgar (Universidad Industrial de Santander, 2016)
El proyecto tuvo como objetivo conocer la composición microbiana de mantos de carbón de la formación geológica Guadas y la complementariedad de los métodos microbiológicos con los métodos moleculares. Se desarrollaron muestreos en las minas de carbón localizadas en la sección denominada “El Triunfo” en el municipio Ubaté (Cundinamarca, Colombia), estas muestras fueron caracterizadas físicoquímicamente (Mayorga, 2012) para determinar la presencia de gas metano. Las muestras que presentaron sesgos de metano fueron cultivadas en medios enriquecidos, y caracterizados visualmente a través de la captura de gas en tubos Durham. Se realizó la identificación molecular del cultivo al que se extrajo el ADN del metagenoma y se amplifico usando como marcador de selección el gen ribosomal 16S mediante el uso de cebadores específicos para Bacterias, Arqueobacterias y metanobacterias. Usando el sistema de clonación “Clone JET™PCR Cloning Kit” que contiene el vector pJET1.2/blunt el cual expresa selección a través del gen Killer (Eco47IR) que permite que solo células recombinantes expresen resistencia a la ampicilina; como huésped se usa Escherichia coli JM101 (ATCC®33876™). Se seleccionaron las colonias recombinantes, que fueron aisladas y cultivadas en un medio enriquecido. Los cultivos fueron usados para la extracción de ADN plásmidico, el cual fue amplificado con los cebadores específicos del vector pJET1.2/blunt y secuenciados para identificar molecularmente las bacterias presentes. Se obtuvieron 169 clonas de las cuales 18 arrojaron un índice de identidad del 87- 95% para el género Gracilibacter sp y las restantes 151 un índice de identidad para Escherichia coli del 90-99%. Las bacterias del genero Gracilibacter sp son anaerobias estrictas además de fermentadores facultativos o estrictos que generan productos como el acetato, CO2 y H2 usados por bacterias metanogénicas acetoclasticas. Con el método molecular y microbiológico se logró aumentar el número de especies identificadas dentro del cultivo enriquecido, lo cual demuestra que son complementarios.
Metanogenomic, Bacteria, Coal Beds, Molecular Identification.
Keywords: Metagenómica; Bacterias; Mantos De Carbón; Identificación Molecular; The project aimed to know the microbial composition of coal seams of the geological formation Guadas and complementarity of microbiological methods with molecular methods. Samples were developed in the coal mines located in the section called "El Triunfo" in the municipality Ubaté (Cundinamarca; Colombia); these samples were characterized physico-chemically (Mayorga; 2012) to determine the presence of methane gas. Samples showing bias methane were grown in rich media; and visually characterized by capturing gas in Durham tubes. Molecular identification of the crop to which the DNA was extracted and amplified using metagenome as selection marker the 16S ribosomal gene using primers specific for bacteria; Archaebacteria and metanobacterias performed. Using the cloning system "Clone JET ™ PCR Cloning Kit" containing the pJET1.2 / blunt vector which expresses selection through Killer (Eco47IR) gene which allows cells to express recombinant single ampicillin resistance; as host Escherichia coli JM101 used (ATCC®33876 ™). Recombinant colonies; which were isolated and cultured in an enriched media were selected. The cultures were used for extraction of plasmid DNA; which was amplified with vector specific primers pJET1.2 / blunt and sequenced to molecularly identify the bacteria present. 169 clones of which 18 showed a rate of 87-95% identity to gender Gracilibacter sp and the remaining 151 index for Escherichia coli identity of 90-99% were obtained. Gracilibacter genus bacteria are strictly anaerobic sp fermenters addition facultative or strict generating products such as acetate; CO2 and H2 used by methanogenic bacteria acetoclasticas. With the molecular and microbiological method succeeded in increasing the number of species identified in the enriched culture; which shows that they are.