Attribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0)Florez Escobar, Alvaro MauricioRueda Forero, Nohora Juliana2024-03-0320162024-03-0320162016https://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/35214Las enzimas lactonasas degradan señales Quorum Sensing por medio de la hidrólisis mediante un fenómeno conocido como Quorum Quenching. Este trabajo se propuso mejorar la propiedades catalíticas de la enzima lactonasa Aiiade Bacillus thuringiensis147-115-16, introduciendo mutaciones aleatorias en el gen aiiA mediante Error Prone PCR. Producto de la mutagénesis se seleccionaron 10 variantes con actividad frente los biosensores CV026 y NTL4.Las variantes mostraron homología con respecto al gen parental. Las mutaciones ocurrieron en su mayoría en el extremo carboxi terminal y la tasa de mutaciones fue de 0,020. De las 10 variantes, se seleccionaron 4 de las cuales, la 852 mostró la mejor actividad para C6-HSL, C8-HSL, C6-Oxo-HSL y una actividad reducida pero detectable frente a C12-Oxo-HSL. Los ensayos de HPLC-MS con la proteína purificada mostraron una actividad catalítica de 0.9 mmol/min-1/mg-1 para C8-HSL, seguida por C6-oxo-HSL (0,8 mmol/min-1/mg-1). Así mismo, presentó actividad catalítica entre 20°C y 70°C y entre pH 4 y 8. El Km para C8-HSL fue de 12,6 mM y para C6-Oxo-HSL de 4,83 mM. La variante exhibió 3,3 veces menor afinidad con C8-HSL que la nativa (Km= 3,81) pero el índice de especificidad aumentó 4,2 x 106 veces. Esta variante mostró una región mutada 240-KRVVECSRNIY-250 y una adición S251. Además, mostró la capacidad de atenuar la infección producida por Pectobacterium carotovorum en papa y por A. tumefasciens en zanahoria. Los resultados obtenidos demuestran que por las características que presentó la variante 852 con respecto a la nativa, es una enzima promisoria para aplicaciones en nanobiotecnología para el control de señales QS tipo C8-HSL y C6-Oxo-HSL.application/pdfspahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/LactonasaBacillus ThuringiensisError Prone PcrQuórum QuenchingUniversidad Industrial de SantanderTesis/Trabajo de grado - Monografía - MaestriaUniversidad Industrial de Santanderhttps://noesis.uis.edu.coLactonases are capable of degrading Quorum Sensing signals through hydrolysis by a phenomenon called Quorum Quenching. This work aimed to improve the catalytic properties of the lactonase enzyme Aiia from Bacillus thuringiensis147-115-16by introducing random mutations into the gene aiiA by Error Prone PCR. Product of the mutagenesiswe selected 10 variants with activity by using CV026 and NTL4 as biosensors. These variants showed homology to the parental gene and the mutations occurred mostly at the C-terminal. The mutation rate was of 0020. From the 10 variantswe selected four and from thesevariant 852 exhibited the best activity for C6-HSLC8-HSLC6-Oxo-HSL and low but detectable activity against C12-Oxo-HSL. The HPLC-MS assays with the purified protein showed a catalytic activity of 09 mmol/min-1/mg-1to C8-HSLfollowed by C6-oxo-HSL (08 mmol/min-1/mg-1). In additionthe catalytic activity between 20°C and 70°C and pH between 4 and 8 were also measured. The Km for C8-HSL was 126 mM and for C6-Oxo-HSL was 483 mM. The variant exhibited 33-fold lower affinity with C8-HSL than the native did (Km = 3.81) but the specificity index increased 42 x 106 fold. This variant showed a 240-KRVVECSRNIY-250 mutated region and an insertion of S251. It also showed the ability to attenuate infection produced by Pectobacterium carotovorum in potato and Agrobacterium tumefaciens in carrot. The results showed that due to the characteristics of variant 852 with respect to the nativeit is a promising enzyme for further applications in nanobiotechnology to control QS signals such as C8-HSL and C6-Oxo-HSL.info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)