Maestría en Microbiología

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Browsing Maestría en Microbiología by browse.metadata.advisor "Cruz Rodríguez, Nataly"

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    Establecimiento de líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de precursores b con coexpresión constitutiva e inducible de los genes id1, id3 e igj mediante plásmidos recombinantes
    (Universidad Industrial de Santander, 2021) Rincón Reyes, Diego Fernando; Gutiérrez Triana, José Arturo; Cruz Rodríguez, Nataly
    TetOn; Tol2 transposasa La leucemia linfoblástica aguda de precursores B (LLAB) es una neoplasia hematológica con una alta incidencia en Colombia y unos bajos indicadores de supervivencia en comparación con otros países del mundo (Allemani et al., 2018). Actualmente, la información sobre los determinantes moleculares de la LLAB en Colombia son muy limitados. Debido a esto, nuestro grupo identificó una firma de expresión génica que se correlaciona con el pronóstico de los pacientes adultos colombianos con LLAB (CruzRodriguez et al., 2016). Los pacientes que sobreexpresan simultáneamente los genes ID1, ID3 e IGJ muestran una baja respuesta al tratamiento de inducción y una baja supervivencia, lo que sugiere que estos genes podrían ser parte de un mecanismo de resistencia de las células leucémicas hacia los agentes quimioterapéuticos. Para probar esta hipótesis, integramos copias adicionales de los genes ID1, ID3 e IGJ en el genoma de la línea celular LLAB NALM6 con el fin de manipular simultáneamente su expresión. Esto se logró usando un policistrón compuesto de las secuencias codificantes de cada gen de interés marcado con péptidos etiqueta y separados por péptidos de autoclivaje virales tipo P2A. El policistrón fue regulado por un promotor constitutivo (CMV) o un promotor inducible dependiente de tetraciclina (TRE3G). La integración genómica fue realizada por la enzima Tol2 transposasa. Analizamos la expresión de la firma y sus productos en modelos estables usando RTqPCR y Western blot. Encontramos que, a diferencia de las células 293T, en los modelos constitutivos NALM6 el policistrón está sujeto a un silenciamiento activo, mientras que el sistema inducible utilizado no logró sobreexpresar los genes de interés en ninguna línea. Sorpresivamente, se detectó una alteración en los niveles de expresión endógena del gen IGJ por la presencia de los transgenes en el genoma. Proponemos recomendaciones para ajustar los modelos y obtener los resultados esperados
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    Establecimiento de líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de precursores b con coexpresión constitutiva e inducible de los genes ID1, ID3 e IGJ mediante plásmidos recombinantes
    (Universidad Industrial de Santander, 2021) Rincón Reyes, Diego Fernando; Cruz Rodríguez, Nataly; Gutiérrez Triana, José Arturo; Rey Buitrago, Mauricio; Terán Pérez, Wilson
    La leucemia linfoblástica aguda de precursores B (LLA-B) es una neoplasia hematológica con una alta incidencia en Colombia y unos bajos indicadores de supervivencia en comparación con otros países del mundo (Allemani et al., 2018). Actualmente, la información sobre los determinantes moleculares de la LLA-B en Colombia son muy limitados. Debido a esto, nuestro grupo identificó una firma de expresión génica que se correlaciona con el pronóstico de los pacientes adultos colombianos con LLA-B (Cruz-Rodriguez et al., 2016). Los pacientes que sobreexpresan simultáneamente los genes ID1, ID3 e IGJ muestran una baja respuesta al tratamiento de inducción y una baja supervivencia, lo que sugiere que estos genes podrían ser parte de un mecanismo de resistencia de las células leucémicas hacia los agentes quimioterapéuticos. Para probar esta hipótesis, integramos copias adicionales de los genes ID1, ID3 e IGJ en el genoma de la línea celular LLA-B NALM-6 con el fin de manipular simultáneamente su expresión. Esto se logró usando un policistrón compuesto de las secuencias codificantes de cada gen de interés marcado con péptidos etiqueta y separados por péptidos de autoclivaje virales tipo P2A. El policistrón fue regulado por un promotor constitutivo (CMV) o un promotor inducible dependiente de tetraciclina (TRE3G). La integración genómica fue realizada por la enzima Tol2 transposasa. Analizamos la expresión de la firma y sus productos en modelos estables usando RT-qPCR y Western blot. Encontramos que, a diferencia de las células 293T, en los modelos constitutivos NALM-6 el policistrón está sujeto a un silenciamiento activo, mientras que el sistema inducible utilizado no logró sobreexpresar los genes de interés en ninguna línea. Sorpresivamente, se detectó una alteración en los niveles de expresión endógena del gen IGJ por la presencia de los transgenes en el genoma. Proponemos recomendaciones para ajustar los modelos y obtener los resultados esperados.
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    Evaluación del efecto de la modulación de la firma génica de mal pronóstico ID1/ID3/IGJ en un modelo celular de LLA-B
    (Universidad Industrial de Santander, 2022-03-30) Padilla Agudelo, José Luis; Guitiérrez Triana, José Arturo; Cruz Rodríguez, Nataly; Pabón Martínez, Yarley Vladimir; Alfonso, Julieta
    La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es una neoplasia hematológica con una alta incidencia en Colombia, con bajas tasas de respuesta al tratamiento y curación comparado con otros países (Allemani et al., 2018). Actualmente en Colombia existe escasa información de las características moleculares de la LLA, y de los posibles mecanismos en la población Colombiana que podrían estar influyendo en la respuesta del tratamiento. Estudios previos realizados por nuestra línea de investigación, en pacientes adultos colombianos con LLA-B identificaron, por primera vez un perfil de expresión génica diferencial entre pacientes respondedores y no respondedores al tratamiento quimioterapéutico de inducción. Este perfil se caracterizó por una elevada expresión simultánea de los genes ID1 (DNA-binding protein inhibitor 1), ID3 (DNA binding protein inhibitor 3) e IGJ (Immunoglobulin J polypeptide). Genes que están implicados en diversos procesos tumorales (Cruz-Rodriguez et al., 2016a). Sin embargo, se desconoce el posible mecanismo en cómo estos genes están involucrados en el desenlace clínico y la baja respuesta al tratamiento en pacientes colombianos. Con el propósito de evaluar el posible mecanismo e importancia de estos genes en el desarrollo de pacientes colombianos con LLA, desarrollamos la modificación genética de la línea de leucemia linfoblástica aguda NALM-6 utilizando los sistemas CRISPR-Cas9 y Tol2-transposasa. Lo anterior, con el objetivo de sobreexpresar cada uno de los genes de la firma génica (ID1, ID3 e IGJ) y evaluar las posibles alteraciones en la división celular y la resistencia a agentes quimioterapéuticos empleados rutinariamente en el tratamiento de LLA. Al analizar la expresión génica mediante la técnica RT-qPCR utilizando las líneas estables NALM-6 encontramos que la sobreexpresión no se presentó en todos los modelos transfectados, sin embargo, se evidenció que los cambios en los niveles de expresión génica se pueden lograr mediante otros sistemas de expresión; lo cual nos llevó a inferir una relación interespecífica entre estos genes. Así mismo, mediante la técnica de western blot descubrimos que los transgenes no se expresan a nivel de proteína, independientemente del sistema de integración usado, a diferencia de las células HEK293 utilizadas como control. Por lo anterior, proponemos un posible mecanismo epigenético independiente del transgén que podría estar relacionada con el promotor de citomegalovirus. Adicionalmente, la evaluación de quimiorresistencia y proliferación se llevada a cabo en la línea estable pST-ID1, evidenció diferentes comportamientos de tasa de división y resistencia respecto a la línea celular sin modificación genética.