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Estandarización de una qpcr multiplex del oncogén e7 para genotipificación de virus del papiloma humano de alto riesgo

Resumen

La infección persistente con Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo (VPHAR) induce cáncer cervical. Para su detección se realizan pruebas moleculares que amplifican el gen L1 del VPH. Sin embargo, a diferencia del gen L1, que puede perderse hasta en el 11% de los casos durante la integración del ADN viral en el genoma del hospedero originando falsos negativos, el oncogén E7 se expresa durante todas las etapas de progresión de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue estandarizar cuatro PCR multiplex en tiempo real del oncogén E7 (qPCR multiplex de E7) para genotipificación y cuantificación de 14 VPHAR. Para esto se aislaron y ligaron en un vector de clonación los marcos de lectura abiertos del gen E7 de VPH16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 59, 68 y 73. Estos se emplearon como genes blanco en la estandarización de la qPCR multiplex de E7 y se usaron cebadores y sondas de hidrólisis específicamente diseñados para cada genotipo. Como estándar de referencia se utilizó la genotipificación de VPH por hibridación reversa dot blot del gen L1. Los resultados muestran que la E7qPCR amplificó los 14 genotipos de VPHAR con límites de detección desde 10 copias, ciclos umbrales de cuantificación (Cq) desde 18 ciclos, análisis de curva de fusión que revelan productos específicos con picos de fusión entre 78,583,0°C, eficiencias entre el 82 y 111%; con pendientes de la curva alrededor de 3,8 y 3,0 y valores R2 > 0,97. La qPCR multiplex de E7 fue capaz de detectar y cuantificar 14 genotipos de VPHAR con una excelente especificidad y sensibilidad analíticas. Considerando estos resultados esta prueba podría ser más sensible para diagnosticar infecciones por VPHAR, por lo tanto, se espera continuar con un estudio de evaluación de tecnología diagnóstica de fase 2.