Reacción combinada de la amilosacarasa y la ciclodextrina glucosiltransferasa para la producción de ciclodextrinas a partir de sacarosa y lixiviados del mucílago de cacao

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dc.contributor.advisorCano Calle, Hermínsul de Jesús
dc.contributor.advisorHernández Torres, Jorge
dc.contributor.authorPico Martínez, Leidy Rocío
dc.contributor.evaluatorMiura da Costa, Andréa
dc.contributor.evaluatorBuranelo Egea, Mariana
dc.contributor.evaluatorde Paula, Claudia Denise
dc.date.accessioned2022-04-01T03:27:30Z
dc.date.available2022-04-01T03:27:30Z
dc.date.created2021
dc.date.issued2021
dc.description.abstractLas ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos compuestos de diferentes números de subunidades de glucopiranosa enlazadas en α-(1,4). Los CDs se producen comercialmente a partir de almidón, mediante la acción de la ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa), que generalmente cataliza la ciclación del almidón y los α-(1,4)-glucanos producidos mediante reacciones de transglicosilación intramolecular. Un trabajo reciente desarrolló un proceso enzimático novedoso, utilizando sacarosa como materia prima en lugar de almidón, para reducir el tiempo y consumo de energía en la producción de CDs a nivel industrial. En este proceso, la amilosacarasa (AS) cataliza la síntesis de polímeros de α-(1,4)-glucanos a partir de moléculas de sacarosa, abriendo así la posibilidad de explorar otros sustratos ricos en azúcar disponibles comercialmente. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la acción combinada de AS de y CGTasa de Bacillus macerans, para producir CDs en una sola reacción a partir de mucílago de cacao y sacarosa como sustratos. Se utilizaron dos estrategias metodológicas: 1) probar la acción combinada de la AS y la CGTasa agregadas simultáneamente; 2) Evaluar la proteína AS-CGTasa, que surge como producto de la fusión en tándem de los genes AS y CGTasa. El primer paso implicó el uso de herramientas bioinformáticas para el diseño y análisis de la fusión AS-CGTasa. Como resultado, los modelos 3D de AS·CGTasa adquirieron una conformación con dos subunidades AS y CGTasa unidas por un motivo GGGS y se analizaron mediante simulaciones de dinámica molecular (GROMACS) para seleccionar el modelo más estable y evaluarlo experimentalmente. Los análisis in vitro mostraron que AS·CGTasa se comporta como una multienzima que es capaz de sintetizar CDs (sacarosa: α-CDs = 325 nmol, β-CDs = 297 nmol y Mucílago: α-CDs = 287 nmol, β-CDs = 259 nmol) en un solo paso a través de las reacciones acopladas de AS y CGTasa. En general, los resultados experimentales demostraron la capacidad de la reacción combinada de AS + CGTasa y la fusión AS·CGTasa para producir CDs en una reacción de un solo paso, a partir de sustratos no convencionales como el mucílago de cacao y la sacarosa. A partir de los resultados concluimos que el mucílago de cacao es un sustrato prometedor para la síntesis de CDs gracias a su aporte de monosacáridos y oligosacáridos. Además, se discute el papel de los monosacáridos como intermediarios en la reacción de polimerización de α-(1,4)-glucanos. Estos resultados pueden ser aplicados a futuro para optimizar los procesos de bioconversión de CDs a partir de mucílago de cacao u otros sustratos ricos en azúcar y que no requieran procesamiento industrial convencional.
dc.description.abstractenglishCyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides composed of different numbers of α-(1,4)-linked glucopyranose subunits. CDs are commercially produced from starch, through the action of cyclodextrin glucanotransferase (CGTase), which generally catalyzes the cyclization of starch and related α-(1,4)-glucans via intramolecular transglycosylation reactions. A recent work developed a novel enzymatic process, utilizing sucrose as raw material instead of starch, to reduce time and energy consumption of CDs production at the industrial level. In this process, a glucosyltransferase named amylosucrase (AS) catalyses the synthesis of α-(1,4)-glucan polymers from sucrose molecules, opening the possibility of exploring other commercially available sugar-rich substrates. The aim of this project was to test the combined action of AS from Neisseria polysaccharea and CGTase from Bacillus macerans, to produce CDs in a one-pot reaction from cocoa mucilage and sucrose as substrates. Two methodological strategies were used: 1) test the combined actions of AS and CGTase added simultaneously. 2) To evaluate the AS·CGTase fusion protein, which arises as a product of the tandem fusion of the AS and CGTase genes. The first step involved the use of bioinformatics tools for the design and analysis of the AS·CGTase fusion. As a result, 3D models of AS.CGTase acquired a conformation with two AS and CGTase subunits linked by a GGGS motif and were analyzed based on molecular dynamics simulations (GROMACS) to select the most stable ones from laboratory testing. In vitro analyzes showed that AS.CGTase behaves like a multienzyme that is capable of synthesizing CDs (sucrose: α-CDs = 325 nmol, β-CDs = 297 nmol and mucilage: α-CDs = 287 nmol, β-CDs = 259 nmol) in a single step through the coupled reactions of AS and CGTase. In general, experimental results demonstrated the ability of the dual enzyme reaction of AS+CGTase, and the AS.CGTase fusion to produce CDs in a one-pot reaction, from non-conventional substrates such as cocoa mucilage and sucrose. Cocoa mucilage is a promising substrate for the synthesis of CDs thanks to its contribution of monosaccharides and oligosaccharides. The role of monosaccharides as an intermediate in the polymerization reaction of α-(1,4)-glucans are discussed. These results can be applied in the future to optimize CD bioconversion processes from cocoa mucilage or other substrates rich in sugar and that do not require conventional industrial processing.
dc.description.cvlachttps://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0001607968
dc.description.degreelevelMaestría
dc.description.degreenameMagíster en Biología
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dc.identifier.instnameUniversidad Industrial de Santander
dc.identifier.reponameUniversidad Industrial de Santander
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dc.identifier.urihttps://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/9340
dc.language.isospa
dc.publisherUniversidad Industrial de Santander
dc.publisher.facultyFacultad de Ciencias
dc.publisher.programMaestría en Biología
dc.publisher.schoolEscuela de Biología
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dc.rights.coarhttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.rights.creativecommonsAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)
dc.rights.licenseAttribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0)
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectCiclodextrinas
dc.subjectAmilosacarasa
dc.subjectCiclodextrina glucosiltransferasa
dc.subjectProteína fusión
dc.subjectMucílago de cacao
dc.subject.keywordCyclodextrins
dc.subject.keywordAmylosucrase
dc.subject.keywordCyclodextrin Glucanotransferase
dc.subject.keywordOne-Pot Synthesis
dc.subject.keywordFusion Protein
dc.subject.keywordCocoa Mucilage
dc.titleReacción combinada de la amilosacarasa y la ciclodextrina glucosiltransferasa para la producción de ciclodextrinas a partir de sacarosa y lixiviados del mucílago de cacao
dc.title.englishCombined reaction of amylosucrase and cyclodextrin glucanotransferase to produce cyclodextrins from sucrose and cocoa mucílage
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