Estandarización de una qPCR multiplex del oncogén E7 para genotipificación de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo

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dc.contributor.advisorMartínez Vega, Ruth Aralí
dc.contributor.advisorRincón Orozco, Bladimiro
dc.contributor.authorPeña López, Brigitte Ofelia
dc.contributor.evaluatorSoto de León, Sara Cecilia
dc.contributor.evaluatorVargas Castellanos, Clara Inés
dc.date.accessioned2022-04-01T04:14:53Z
dc.date.available2022-04-01T04:14:53Z
dc.date.created2021
dc.date.issued2021
dc.description.abstractLa infección persistente con Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo (VPH-AR) induce cáncer cervical. Para su detección se realizan pruebas moleculares que amplifican el gen L1 del VPH. Sin embargo, a diferencia del gen L1, que puede perderse hasta en el 11% de los casos durante la integración del ADN viral en el genoma del hospedero originando falsos negativos, el oncogén E7 se expresa durante todas las etapas de progresión de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue estandarizar cuatro PCR multiplex en tiempo real del oncogén E7 (qPCR multiplex de E7) para genotipificación y cuantificación de 14 VPH-AR. Para esto se aislaron y ligaron en un vector de clonación los marcos de lectura abiertos del gen E7 de VPH-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58 -59, -68 y -73. Estos se emplearon como genes blanco en la estandarización de la qPCR multiplex de E7 y se usaron cebadores y sondas de hidrólisis específicamente diseñados para cada genotipo. Como estándar de referencia se utilizó la genotipificación de VPH por hibridación reversa dot blot del gen L1. Los resultados muestran que la E7-qPCR amplificó los 14 genotipos de VPH-AR con límites de detección desde 10 copias, ciclos umbrales de cuantificación (Cq) desde 18 ciclos, análisis de curva de fusión que revelan productos específicos con picos de fusión entre 78,5-83,0°C, eficiencias entre el 82 y 111%; con pendientes de la curva alrededor de -3,8 y -3,0 y valores R2 > 0,97. La qPCR multiplex de E7 fue capaz de detectar y cuantificar 14 genotipos de VPH-AR con una excelente especificidad y sensibilidad analíticas. Considerando estos resultados esta prueba podría ser más sensible para diagnosticar infecciones por VPH-AR, por lo tanto, se espera continuar con un estudio de evaluación de tecnología diagnóstica de fase 2.
dc.description.abstractenglishPersistent infection with High-Risk Human Papillomavirus (HR-HPV) induces cervical cancer. For its detection, molecular tests are carried out that amplify the HPV L1 gene. However, unlike the L1 gene, which can be lost in up to 11% of cases during the integration of viral DNA into the host genome causing false negatives, the E7 oncogene is expressed during all stages of disease progression. The objective of this work was to standardize four real-time multiplex PCR of the E7 oncogene (E7 multiplex qPCR) for genotyping and quantification of 14 HR-HPV. For this, the open reading frames of the HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58 -59, -68 and -73 E7 gene were isolated and ligated in a cloning vector. These were used as target genes in the standardization of the E7 multiplex qPCR and hydrolysis primers and probes specifically designed for each genotype were used. As a reference standard, HPV genotyping by dot blot reverse hybridization of the L1 gene was used. The results show that the E7-qPCR amplified the 14 HR-HPV genotypes with detection limits from 10 copies, threshold cycles of quantification (Cq) from 18 cycles, melting curve analysis revealing specific products with melting peaks between 78.5-83.0 ° C, efficiencies between 82 and 111%; with slopes of the curve around -3.8 and -3.0 and R2 values> 0.97. The E7 multiplex qPCR was able to detect and quantify 14 HR-HPV genotypes with excellent specificity and analytical sensitivity. Considering these results, this test could be more sensitive to diagnose HR-HPV infections, therefore, it is expected to continue with a phase 2 diagnostic technology evaluation study.
dc.description.degreelevelMaestría
dc.description.degreenameMagíster en Microbiología
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.identifier.instnameUniversidad Industrial de Santander
dc.identifier.reponameUniversidad Industrial de Santander
dc.identifier.repourlhttps://noesis.uis.edu.co
dc.identifier.urihttps://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/9528
dc.language.isospa
dc.publisherUniversidad Industrial de Santander
dc.publisher.facultyFacultad de Salud
dc.publisher.programMaestría en Microbiología
dc.publisher.schoolEscuela de Microbiología
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coarhttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.rights.creativecommonsAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)
dc.rights.licenseAttribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0)
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectInfecciones por papilomavirus
dc.subjectNeoplasias del cuello uterino
dc.subjectGenotipificación
dc.subjectReacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
dc.subjectOncogén E7
dc.subject.keywordPapillomavirus Infections
dc.subject.keywordUterine Cervical Neoplasms
dc.subject.keywordGenotyping
dc.subject.keywordReal-Time Polymerase Chain Reaction
dc.subject.keywordE7 Oncogene
dc.titleEstandarización de una qPCR multiplex del oncogén E7 para genotipificación de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo
dc.title.englishStandardization of a multiplex qPCR of the E7 oncogene for genotyping of high-risk Human Papillomavirus
dc.type.coarhttp://purl.org/coar/resource_type/c_bdcc
dc.type.hasversionhttp://purl.org/coar/version/c_b1a7d7d4d402bcce
dc.type.localTesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestría
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