El canto de anuncio de los anuros desempeña un papel fundamental en el éxito reproductivo y con frecuencia está influenciado por factores biológicos y ambientales. Rheobates palmatus, una rana endémica de los Andes colombianos, habita un amplio gradiente altitudinal donde se espera que las señales acústicas varíen debido a restricciones ambientales y fisiológicas. Este estudio evalúa la variación en los parámetros temporales y espectrales del canto de anuncio a lo largo de un gradiente altitudinal en la Serranía de los Yariguíes, Santander, Colombia. Los individuos fueron grabados entre 300 y 2000 m s.n.m. utilizando métodos bioacústicos estandarizados. Analizamos las relaciones entre la estructura del canto, el tamaño corporal, la humedad ambiental, la temperatura corporal, la temperatura del sustrato y la temperatura ambiente medidas en los sitios de vocalización. Los resultados revelan diferenciación acústica a lo largo del gradiente. En lugar de una variación clinal continua, emergen dos grupos acústicos claramente diferenciados, separados por una estrecha zona de transición altitudinal. Los individuos a mayores elevaciones emiten cantos con frecuencias dominantes más bajas y mayor duración, mientras que los individuos a menores elevaciones vocalizan con frecuencias más altas y cantos más cortos. Los análisis multivariados indican que estas diferencias están asociadas con variaciones en el tamaño corporal y en variables térmicas a lo largo del gradiente. Estos hallazgos indican una divergencia acústica mediada por el ambiente, consistente con restricciones ecofisiológicas en la producción de señales en anfibios montanos tropicales.