Protein engineering of formate dehydrogenase h (fdh-h) to enhance hydrogen production via error-prone pcr

Abstract

El complejo Liasa para producir Hidrógeno del Formato (FHL) de la Escherichia coli es el responsable de la conversión del formato en dióxido de carbono (CO2) e hidrógeno (H2) bajo condiciones anaeróbicas y en la ausencia de receptores de electrones. El principio activo del complejo consta de siete proteínas, seis provenientes de la hidrogenada 3 codificada por el operador hyc (HycBCDEFG) y uno de la deshidrogenasa del formato H (Fdh-H). Fdh-H, codificada por el gen fdhF, es una proteína citoplasmática de 79 kDa y contiene selenocisteina, molibdeno y un grupo de [4Fe-4S] en su sitio activo. En este estudio, aplicamos ingeniería a la fdhF (715 amino ácidos) para aumentar la producción de hidrógeno por un proceso de error-prone y reacción en cadena de la polimerasa (epPCR) usando un huésped que carecía de actividad de la hidrogenada 1 (hyaB codifica la subunidad mas grande) y la hidrogenada 2 (hybC codifica la subunidad mas grande) y de la deshidrogenasa del formato H a través de las mutaciones hyaB hybC fdhF. Para generar las mutaciones aleatorias mediante la implementación de la técnica de epPCR, se utilizo como plantilla el plasmido pCA24N-fdhF. Una variante mejorada de la fdhF se obtuvo con una membrana chemochromica que detecta directamente la producción de hidrógeno a partir de colonias individuales. La variante obtenida a travéz de epPCR tiene una mutación (Y513H) y produce 12 veces más hidrógeno que la cepa sin mutaciones de la fdhF. Además, realizamos mutagénesis saturada en esta variante para obtener una mutante (H513Q) que produce 6 veces más hidrógeno que la mutante (Y513H).