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Diseño de un sistema CRISPR/LbCas12a y su evaluación en detección por corte de los genes 18s, H2A y Cytb de Trypanosoma cruzi en Rhodnius pallescens silvestres (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae).

Resumen

La enfermedad de Chagas causada por el parásito Trypanosoma cruzi es una dolencia de importancia en la salud pública. En la actualidad, los sistemas de diagnóstico del agente etiológico son diversos, abarcando desde enfoques sencillos, como la observación de frotis sanguíneo, pruebas serológicas, hasta pruebas moleculares, como la qPCR y PCR. En la búsqueda de alternativas de diagnosis que combinen eficiencia, bajo coste y precisión, se ofrece la aplicación de la tecnología CRISPR en la detección de secuencias específicas como análisis diagnóstico. El objetivo del presente trabajo consistió en diseñar un sistema de detección de ADN por corte específico utilizando la tecnología CRISPR/LbCas12a dirigido los genes Citocromo B, Subunidad ribosomal 18s y el gen de histona H2A de Trypanosoma cruzi en muestras de intestino de Rhodnius pallescens. Para ello, se implementó el sistema de corte colateral dirigido por guías de ARN diseñadas, usando amplificación por PCR y en ADN directo. La visualización del corte del amplificado, se realizó en gel de agarosa. Adicionalmente, empleando un reportero fluorescente, se evaluó el corte por espectrofotometría y confirmación visual bajo luz ultravioleta. Los resultados revelaron una eficiente capacidad de clivaje con la guía del gen Cytb, permitiendo una determinación efectiva y sensible incluso en concentraciones bajas como por ejemplo 1 ng/uL del amplificado. En contraste, en las pruebas en ADN sin preamplificación no hay evidencia del corte. El sistema CRISPR/LbCas12a con amplificación por PCR demuestró ser efectivo para la detección de Trypanosoma cruzi en el vector Rhodnius pallecens. Para que el sistema sea asequible a cualquier necesidad de laboratorio se sugiere la implementación de técnicas de amplificación isotérmica que permita reducir el tiempo de detección y la necesidad de equipamiento técnico.