Identificación de bacterias del carbón mediante análisis de secuencias del gen ribosomal 16s

Abstract

El proyecto tuvo como objetivo conocer la composición microbiana de mantos de carbón de la formación geológica Guadas y la complementariedad de los métodos microbiológicos con los métodos moleculares. Se desarrollaron muestreos en las minas de carbón localizadas en la sección denominada “El Triunfo” en el municipio Ubaté (Cundinamarca, Colombia), estas muestras fueron caracterizadas físicoquímicamente (Mayorga, 2012) para determinar la presencia de gas metano. Las muestras que presentaron sesgos de metano fueron cultivadas en medios enriquecidos, y caracterizados visualmente a través de la captura de gas en tubos Durham. Se realizó la identificación molecular del cultivo al que se extrajo el ADN del metagenoma y se amplifico usando como marcador de selección el gen ribosomal 16S mediante el uso de cebadores específicos para Bacterias, Arqueobacterias y metanobacterias. Usando el sistema de clonación “Clone JET™PCR Cloning Kit” que contiene el vector pJET1.2/blunt el cual expresa selección a través del gen Killer (Eco47IR) que permite que solo células recombinantes expresen resistencia a la ampicilina; como huésped se usa Escherichia coli JM101 (ATCC®33876™). Se seleccionaron las colonias recombinantes, que fueron aisladas y cultivadas en un medio enriquecido. Los cultivos fueron usados para la extracción de ADN plásmidico, el cual fue amplificado con los cebadores específicos del vector pJET1.2/blunt y secuenciados para identificar molecularmente las bacterias presentes. Se obtuvieron 169 clonas de las cuales 18 arrojaron un índice de identidad del 87- 95% para el género Gracilibacter sp y las restantes 151 un índice de identidad para Escherichia coli del 90-99%. Las bacterias del genero Gracilibacter sp son anaerobias estrictas además de fermentadores facultativos o estrictos que generan productos como el acetato, CO2 y H2 usados por bacterias metanogénicas acetoclasticas. Con el método molecular y microbiológico se logró aumentar el número de especies identificadas dentro del cultivo enriquecido, lo cual demuestra que son complementarios.