Caracterización bioinformática y funcional de la enzima fitasa derivada de Klebsiella pneumoniae

Abstract

El fitato es el principal compuesto de reserva de fósforo (P) en las plantas y presenta baja biodisponibilidad por la formación de complejos que dificultan su aprovechamiento. Las fitasas, enzimas que catalizan la hidrólisis del fitato, se usan ampliamente en la industria animal porque optimizan la absorción de fósforo y minimizan la contaminación derivada de los desechos. Los animales monogástricos carecen de estas enzimas, por lo que, el fitato no se degrada y es excretado intacto a través de las heces. La suplementación alimenticia con fitasas surge como una alternativa biotecnológica eficaz para liberar el fósforo en el tracto digestivo y reducir el impacto ambiental asociado. El presente trabajo caracterizó una fitasa de Klebsiella pneumoniae (Fit_KP) frente a una fitasa control de Escherichia coli (Fit_EC) con el fin de compararlas y determinar su potencial en la industria. Análisis in silico evidenciaron que ambas proteínas tenían pesos moleculares de 46-48 kDa y el motivo conservado RHGXRXP HD, confirmando su pertenencia a las fosfatasas ácidas de histidina (HAP), además de modelos estructurales de alta confianza. Seguidamente, se construyeron plásmidos pET-20b(+) con los genes de interés (Fit_KP y Fit_EC), añadiendo el péptido señal y la etiqueta de histidina. Las proteínas se expresaron en E. coli BL21 (DE3), se purificaron usando columnas de afinidad HisTrap FF y se caracterizaron. Ambas fitasas mostraron actividades específicas de 77 U/mg (Fit_KP) y 71.2 U/mg (Fit_EC), pH óptimo de 4.0 y temperaturas óptimas de 50 °C (Fit_KP) y 60 °C (Fit_EC). El Zn²⁺ fue inhibidor, mientras que el EDTA incrementó de forma marcada la actividad. La integración de análisis in silico-in vitro demostró viabilidad para obtener fitasas recombinantes funcionales, en donde Fit_KP se destaca como una candidata sólida para su uso en la nutrición animal.