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Mejoramiento genético por error prone pcr del gen aiiA que codifica para n-acil homoserina lactonasa de bacillus thuringiensis

Resumen

Las enzimas lactonasas degradan señales Quorum Sensing por medio de la hidrólisis mediante un fenómeno conocido como Quorum Quenching. Este trabajo se propuso mejorar la propiedades catalíticas de la enzima lactonasa Aiiade Bacillus thuringiensis147-115-16, introduciendo mutaciones aleatorias en el gen aiiA mediante Error Prone PCR. Producto de la mutagénesis se seleccionaron 10 variantes con actividad frente los biosensores CV026 y NTL4.Las variantes mostraron homología con respecto al gen parental. Las mutaciones ocurrieron en su mayoría en el extremo carboxi terminal y la tasa de mutaciones fue de 0,020. De las 10 variantes, se seleccionaron 4 de las cuales, la 852 mostró la mejor actividad para C6-HSL, C8-HSL, C6-Oxo-HSL y una actividad reducida pero detectable frente a C12-Oxo-HSL. Los ensayos de HPLC-MS con la proteína purificada mostraron una actividad catalítica de 0.9 mmol/min-1/mg-1 para C8-HSL, seguida por C6-oxo-HSL (0,8 mmol/min-1/mg-1). Así mismo, presentó actividad catalítica entre 20°C y 70°C y entre pH 4 y 8. El Km para C8-HSL fue de 12,6 mM y para C6-Oxo-HSL de 4,83 mM. La variante exhibió 3,3 veces menor afinidad con C8-HSL que la nativa (Km= 3,81) pero el índice de especificidad aumentó 4,2 x 106 veces. Esta variante mostró una región mutada 240-KRVVECSRNIY-250 y una adición S251. Además, mostró la capacidad de atenuar la infección producida por Pectobacterium carotovorum en papa y por A. tumefasciens en zanahoria. Los resultados obtenidos demuestran que por las características que presentó la variante 852 con respecto a la nativa, es una enzima promisoria para aplicaciones en nanobiotecnología para el control de señales QS tipo C8-HSL y C6-Oxo-HSL.