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Mutagénesis dirigida de la lacasa cueo de escherichia coli: efectos de la deleción del dominio d2 sobre la actividad enzimática

Resumen

Las lacasas son enzimas que catalizan la oxidación de compuestos fenólicos, junto con la reducción de O2 en agua. Están ampliamente distribuidas en bacterias, hongos, plantas e insectos. Se ha demostrado que en Escherichia coli, la lacasa CueO está involucrada en la homeostasis de cobre gracias a su actividad cuproso oxidasa. CueO actúa como oxidasa de sustratos fenólicos como el DMP, el ABTS, la siringaldazina, etc. Estructuralmente, las lacasas constan de tres dominios cupredoxina D1, D2 y D3. El plegamiento espacial de los tres dominios se ha conservado, sólo D1 y D3 integran átomos de Cu2+ en el sitio activo. Los reportes de lacasas de sólo dos dominios han aumentado. Las pruebas de actividad demuestran que las pequeñas lacasas bacterianas oxidan los mismos sustratos que las lacasas de tres dominios. En el presente trabajo se analiza la función del dominio D2 en las lacasas de tres dominios, si en la naturaleza abundan isoformas de dos dominios que cumplen la misma función oxidasa. Por primera vez se evaluó el efecto de la deleción del dominio D2 de una lacasa de tres. Como modelo se usó la lacasa de CueO de E. coli. Los resultados computaciones y experimentales demostraron que a pesar de la deleción del dominio D2, la pequeña lacasa diseñada (CueO∆D2) mantiene la actividad oxidasa. Se discute, cuál puede ser la función del dominio D2 en las lacasas, si la enzima puede prescindir de este dominio, sin perder su actividad. Finalmente, se diserta sobre las implicaciones evolutivas y funcionales que derivan de los resultados obtenidos. La principal conclusión es que el dominio D2 no ha desaparecido durante la evolución, porque en taxones específicos las lacasas de tres dominios cumplen otras actividades que requieren la presencia del dominio D2, además de garantizar la resistencia a la degradación y la estabilidad estructural