Caracterización bioquímica de la actividad catecol oxidasa de escherichia coli bl21 (de3)

Abstract

En extractos crudos de Escherichia coli BL21 (DE3) se detectó una actividad catecol oxidasa periplásmica, estimulada por la presencia de cobre. Con base en la literatura científica vigente y a los hallazgos preliminares de dicha actividad se le atribuyó en primera instancia a la oxidasa multicobre CueO. Para demostrarlo, en el presente trabajo el gen cueO fue clonado y sobre-expresado con el vector pET-21d (+), en E. coli BL21 (DE3). Se caracterizó la actividad catecol oxidasa in vitro, y se determinaron la influencia del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática. Como resultado se confirmó que la multicobre oxidasa CueO es la responsable de la actividad catecol oxidasa observada en los extractos crudos de E. coli BL21 (DE3). Esta enzima es activada por la presencia de iones Cu2+ a una concentración de 5 mM, además, es termoestable y muestra su mayor actividad in vivo en el periplasma a pH 8.5. Se calculó el rendimiento enzimático en extractos crudos de periplasma para pET_CueO1.5, después de 6 h de inducción con IPTG dando como resultado una actividad enzimática de 2.7 U/mg. CueO podría ser una lacasa bacteriana modelo para el estudio de la evolución de la estructura de las lacasas dado que cumple con condiciones como: su sobreexpresión es abundante en E. coli, no requiere de modificaciones post-traduccionales y es resistente a la degradación por proteasas de E. coli.