Design of sirna sequences and in vitro evaluation against strategic targets of nef gene of human immunodeficiency virus type 1
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Date
2009
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Publisher
Universidad Industrial de Santander
Abstract
RNA interferente (RNAi) es una función biológica conservada de silenciamiento genético mediada por oligonucleótidos pequeños de RNA interferente que destruyen de manera específica RNA mensajeros complementarios. RNAi actúa como un sistema antiviral, así como un sistema de regulación de la expresión genética. Diferentes genes del VIH-1 han sido eficientemente silenciados mediante siRNAs. Sin embargo, mutantes que escapan a este efecto son rápidamente inducidos. Proteínas esenciales para la replicación viral deben trabajar en un amplio rango de mutantes. En caso contrario, proteínas que confieren virulencia, pero no son esenciales para la replicación, cuando son blancos de siRNA podrían inducir la aparición de mutantes de baja virulencia que están bajo una presión selectiva menor. Blancos estratégicos, como secuencias que codifican para dominios altamente conservados y funcionales, pueden atenuar este fenómeno o producir cepas no viables de VIH-1. Nef es una proteína de virulencia, pero no es necesaria para la replicación. En este trabajo, cuatro blancos de siRNA fueron reconocidos para Nef en el tracto de polipurina, región de miristilación, motivo rico en prolinas y región de dimerización. Eficientes siRNAs contra estas regiones fueron identificadas de 11 secuencias de siRNA en forma de pinza (shRNA), las cuales fueron diseñadas manualmente, clonadas como shRNA en un plásmido Pol III y co-transfectadas en células HeLaT4 con un vector reportero que expresa la proteína de fusión Nef-dEGFP. Se identificaron shRNAs altamente eficientes contra la región rica en prolinas (2 secuencias con más del 95% de inhibición), la señal de miristilación (1 secuencia con 95% de inhibición), la región de dimerización (2 secuencias con 95% inhibición) y el Tracto de Polipurina (1 secuencia con 85% de inhibición). Por lo tanto, plásmidos que expresan shRNAs contra VIH-1 generados mediante este método pueden ser mejores candidatos para evitar la inducción de mutantes que escapan al efecto de RNA interferente.
Description
Keywords
VIH-1, Gen nef, RNA interferente, Secuencias pequeñas de RNA interferente-siRNA, Proteína de fusión reportera Nef-dEGFP