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Expresión heteróloga de la lipasa lipa de serratia marcescens en escherichia coli bl21 (de3): uso de una variante soluble para la transesterificacion enzimatica del aceite de palma africana con etanol (biodiesel)

Resumen

En Colombia, una solución económica a la fabricación industrial de biodiésel, por vía enzimática, consiste en producir localmente lipasas a bajo costo. Previamente el laboratorio de Biología Molecular de la Escuela de Biología demostró que la lipasa LipA de Serratia marcescens (Sm_LipA) posee un potencial en la producción de biodiésel. Sin embargo, por su hidrofobicidad, LipA forma cuerpos de inclusión al sobreexpresarla en Escherichia coli. En un macroproyecto del CINBIN, el cual tenía como objetivo diseñar y evaluar in vitro versiones solubles de Sm_LipA, los investigadores concibieron el mutante Sm_LipA_M1, mediante herramientas bioinformáticas. Esta isoforma preveía seis sustituciones de aminoácidos polares o hidrofóbicos por (Glu): I56E, L59E, T119E, I310E, W462E y L463E. Además, según la literatura científica, -sandwich -Terminal. En este trabajo de grado, se sobreexpresó el gen Sm_LipA_M1 en E. coli BL21 (DE3) y se probó la actividad catalítica de la proteína recombinante. Se sintetizó gen mutante y se clonó en el vector pET-22b. Células de E. coli BL21 (DE3) fueron transformadas con el plásmido pET_Sm_LipA_M1 y la expresión se indujo con IPTG. Los resultados mostraron que la proteína Sm_LipA_M1 se localizó como cuerpos de inclusión en las fracciones periplasmática y citoplasmática insoluble. Pruebas de actividad hidrolasa con p-nitrofenil butirato (pNPB) como sustrato, a pH y temperatura optimizados, mostraron una actividad específica que no pudo superar 1 U/mg de extractos crudos de E. coli. Este valor contrasta drásticamente con la actividad específica del tipo salvaje Sm_LipA, sobreexpresada en E. coli (12 U/mg). Se consideró injustificado avanzar hacia la evaluación de la actividad aciltransesterasa, como estaba previsto en el cuarto objetivo general. Se concluyó que las mutaciones impactaron negativamente la estabilidad de la enzima y en la discusión se argumentan las probables fallas en el diseño de Sm_LipA_M1.