Expresión heteróloga de la lipasa lipa de serratia marcescens en escherichia coli bl21 (de3): uso de una variante soluble para la transesterificacion enzimatica del aceite de palma africana con etanol (biodiesel)

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dc.contributor.advisorHernandez Torres, Jorge
dc.contributor.authorDiaz Landinez, Jenny Paola
dc.date.accessioned2023-04-05T03:43:18Z
dc.date.available2023
dc.date.available2023-04-05T03:43:18Z
dc.date.created2019
dc.date.issued2019
dc.description.abstractEn Colombia, una solución económica a la fabricación industrial de biodiésel, por vía enzimática, consiste en producir localmente lipasas a bajo costo. Previamente el laboratorio de Biología Molecular de la Escuela de Biología demostró que la lipasa LipA de Serratia marcescens (Sm_LipA) posee un potencial en la producción de biodiésel. Sin embargo, por su hidrofobicidad, LipA forma cuerpos de inclusión al sobreexpresarla en Escherichia coli. En un macroproyecto del CINBIN, el cual tenía como objetivo diseñar y evaluar in vitro versiones solubles de Sm_LipA, los investigadores concibieron el mutante Sm_LipA_M1, mediante herramientas bioinformáticas. Esta isoforma preveía seis sustituciones de aminoácidos polares o hidrofóbicos por (Glu): I56E, L59E, T119E, I310E, W462E y L463E. Además, según la literatura científica, -sandwich -Terminal. En este trabajo de grado, se sobreexpresó el gen Sm_LipA_M1 en E. coli BL21 (DE3) y se probó la actividad catalítica de la proteína recombinante. Se sintetizó gen mutante y se clonó en el vector pET-22b. Células de E. coli BL21 (DE3) fueron transformadas con el plásmido pET_Sm_LipA_M1 y la expresión se indujo con IPTG. Los resultados mostraron que la proteína Sm_LipA_M1 se localizó como cuerpos de inclusión en las fracciones periplasmática y citoplasmática insoluble. Pruebas de actividad hidrolasa con p-nitrofenil butirato (pNPB) como sustrato, a pH y temperatura optimizados, mostraron una actividad específica que no pudo superar 1 U/mg de extractos crudos de E. coli. Este valor contrasta drásticamente con la actividad específica del tipo salvaje Sm_LipA, sobreexpresada en E. coli (12 U/mg). Se consideró injustificado avanzar hacia la evaluación de la actividad aciltransesterasa, como estaba previsto en el cuarto objetivo general. Se concluyó que las mutaciones impactaron negativamente la estabilidad de la enzima y en la discusión se argumentan las probables fallas en el diseño de Sm_LipA_M1.
dc.description.abstractenglishAn economic solution to the Colombia industrial manufacture of biodiesel, by enzymatic means, consists of locally produced lipases at a low cost. Previously, the Molecular Biology laboratory of the School of Biology demonstrated that the lipase LipA from Serratia marcescens (Sm_LipA) has a strong potential in the production of biodiesel. However, due to its hydrophobicity, Sm_LipA forms inclusion bodies when overexpressed in Escherichia coli. In the context of a macroproject of CINBIN, which aimed to design and evaluate in vitro soluble versions of Sm_LipA, researchers conceived the Sm_LipA_M1 mutant, through bioinformatics tools. This isoform predicted six substitutions of polar or hydrophobic amino acids by Glu: I56E, L59E, T119E, I310E, W462E and L463E. In addition, based on scientific literature, the rational design included a deletion of the -sandwich domain (133) located at C- terminal. In this work, the Sm_LipA_M1 gene was overexpressed in E. coli BL21 (DE3) and the catalytic activity of the recombinant protein was tested. A mutant Sm_LipA_M1 gene was purchased and was cloned into the vector pET-22b. E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with plasmid pET_Sm_LipA_M1 and expression was induced by IPTG. The results showed that the Sm_LipA_M1 protein was in the periplasmic and insoluble cytoplasmic fractions as inclusion bodies. Tests of hydrolase activity with p- nitrophenyl butyrate (pNPB) as substrate, at optimized pH and temperature, showed a specific activity that could not exceed 1 U/mg of crude E. coli extracts. This value contrasts drastically with the specific activity of the wild type Sm_LipA, when overexpressed in E. coli (12 U/mg). It was considered unjustified to undertake the evaluation of acyltransferase activity as expected in the fourth general objective. It was concluded that the mutations negatively impacted the stability of the enzyme; in the discussion some the probable design mistakes of Sm_LipA_M1 are argued.
dc.description.degreelevelPregrado
dc.description.degreenameBiólogo
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.identifier.instnameUniversidad Industrial de Santander
dc.identifier.reponameUniversidad Industrial de Santander
dc.identifier.repourlhttps://noesis.uis.edu.co
dc.identifier.urihttps://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/12716
dc.language.isospa
dc.publisherUniversidad Industrial de Santander
dc.publisher.facultyFacultad de Ciencias
dc.publisher.programBiología
dc.publisher.schoolEscuela de Biología
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coarhttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.rights.creativecommonsAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)
dc.rights.licenseAttribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0)
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectBiotecnología
dc.subjectLipasa
dc.subjectHidrolasa
dc.subjectPnpb
dc.subjectDiseño Racional
dc.subjectBiodiésel.
dc.subject.keywordBiotechnology
dc.subject.keywordLipase
dc.subject.keywordHydrolase
dc.subject.keywordPnpb
dc.subject.keywordRational Design
dc.subject.keywordBiodiesel
dc.titleExpresión heteróloga de la lipasa lipa de serratia marcescens en escherichia coli bl21 (de3): uso de una variante soluble para la transesterificacion enzimatica del aceite de palma africana con etanol (biodiesel)
dc.title.englishHeterologous expression of lipase lipa from serratia marcescens in escherichia coli bl21 (de3): use of a soluble variant for the enzymatic transesterification of african palm oil with ethanol (biodiesel)
dc.type.coarhttp://purl.org/coar/version/c_b1a7d7d4d402bcce
dc.type.hasversionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f
dc.type.localTesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado
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Biología