Estandarización de un protocolo para la producción de la enzima PfuS ADN polimerasa
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Date
2024-08-13
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Publisher
Universidad Industrial de Santander
Abstract
Las enzimas que polimerizan ADN están en todos los organismos y constituyen un insumo fundamental para catalizar la amplificación de ADN in vitro, más conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR. Una de las ADN polimerasas más utilizadas en biología molecular es la Pfu ADN polimerasa, derivada de la arqueobacteria Pyrococcus furiosus. Las ADN polimerasas fusion se caracterizan por estar unidas a un dominio de unión al ADN, lo que les permite recorrer una distancia más larga en comparación con las polimerasas convencionales. Sin embargo, en Colombia son pocos los laboratorios que producen proteínas, por lo que se recurre a la compra de enzimas importadas de otros países, ocasionando dependencia a la importación de herramientas claves en el desarrollo científico. Es por esto que la producción local de esta enzima garantizaría una reducción de los costos, en particular cuando el número de reacciones de PCR es muy alto. Este trabajo de grado tiene como objetivo explorar la expresión recombinante de PfuS ADN polimerasa, con el fin de establecer un protocolo estandarizado y repetible, incluyendo la optimización de las condiciones de expresión y purificación de la enzima, así como la validación de su pureza y actividad mediante ensayos in vitro. Se optimizó la sobreexpresión de la proteína recombinante en el vector pET-30a usando la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó a gran escala en un solo paso con calentamiento, seguido de precipitación con 50% acetona. La caracterización enzimática se realizó mediante ensayos PCR y qPCR, con diferentes genes bacterianos. En conclusión, fue posible estandarizar un protocolo repetible para producir en el laboratorio la enzima fusión PfuS ADN polimerasa aplicable en ensayos de PCR y qPCR.
Description
Keywords
Pyrococcus furiosus, PfuS ADN polimerasa, expresión de proteína, Reacción en cadena de la polimerasa