Estandarización de un protocolo para la producción de la enzima PfuS ADN polimerasa

Jiménez Ramírez, María Juliana

Estandarización de un protocolo para la producción de la enzima PfuS ADN polimerasa

dc.contributor.advisor	Castillo Villamizar, Genis Andrés
dc.contributor.advisor	Hernández Torres, Jorge
dc.contributor.author	Jiménez Ramírez, María Juliana
dc.contributor.evaluator	Martínez Pérez, Francisco José
dc.date.accessioned	2024-08-14T12:08:47Z
dc.date.available	2024-08-14T12:08:47Z
dc.date.created	2024-08-13
dc.date.embargoEnd	2027-08-13
dc.date.issued	2024-08-13
dc.description.abstract	Las enzimas que polimerizan ADN están en todos los organismos y constituyen un insumo fundamental para catalizar la amplificación de ADN in vitro, más conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR. Una de las ADN polimerasas más utilizadas en biología molecular es la Pfu ADN polimerasa, derivada de la arqueobacteria Pyrococcus furiosus. Las ADN polimerasas fusion se caracterizan por estar unidas a un dominio de unión al ADN, lo que les permite recorrer una distancia más larga en comparación con las polimerasas convencionales. Sin embargo, en Colombia son pocos los laboratorios que producen proteínas, por lo que se recurre a la compra de enzimas importadas de otros países, ocasionando dependencia a la importación de herramientas claves en el desarrollo científico. Es por esto que la producción local de esta enzima garantizaría una reducción de los costos, en particular cuando el número de reacciones de PCR es muy alto. Este trabajo de grado tiene como objetivo explorar la expresión recombinante de PfuS ADN polimerasa, con el fin de establecer un protocolo estandarizado y repetible, incluyendo la optimización de las condiciones de expresión y purificación de la enzima, así como la validación de su pureza y actividad mediante ensayos in vitro. Se optimizó la sobreexpresión de la proteína recombinante en el vector pET-30a usando la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó a gran escala en un solo paso con calentamiento, seguido de precipitación con 50% acetona. La caracterización enzimática se realizó mediante ensayos PCR y qPCR, con diferentes genes bacterianos. En conclusión, fue posible estandarizar un protocolo repetible para producir en el laboratorio la enzima fusión PfuS ADN polimerasa aplicable en ensayos de PCR y qPCR.
dc.description.abstractenglish	The enzymes that polymerize DNA are present in all organisms and constitute a fundamental input for catalyzing the amplification of DNA in vitro, more commonly known as Polymerase Chain Reaction or PCR. One of the most commonly used DNA polymerases in molecular biology is Pfu DNA polymerase, derived from the archaeobacterium Pyrococcus furiosus. Fusion DNA polymerases are characterized by their fusion to a DNA binding domain, which allows to traverse a longer distance compared to conventional polymerases. However, in Colombia, there are few laboratories that produce proteins, which leads to the purchase of imported enzymes from other countries, creating a dependence on the importation of key tools in scientific development. Therefore, local production of this enzyme would guarantee a reduction in costs, particularly when the number of PCR reactions is very high. This thesis aims to explore the recombinant expression of PfuS DNA polymerase, in order to establish a standardized and repeatable protocol, including the optimization of expression and purification conditions of the enzyme, as well as the validation of its purity and activity through in vitro assays. The overexpression of the recombinant protein in the pET-30a vector using the Escherichia coli BL21 (DE3) strain was optimized and purified on a large scale in a single step by heating, followed by precipitation with 50% acetone. Enzymatic characterization was performed using PCR and qPCR assays, with different bacterial genes. In conclusion, it was possible to standardize a repeatable protocol to produce the fusion enzyme PfuS DNA polymerase in the laboratory, applicable in PCR and qPCR assays.
dc.description.degreelevel	Pregrado
dc.description.degreename	Biólogo
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.identifier.instname	Universidad Industrial de Santander
dc.identifier.reponame	Universidad Industrial de Santander
dc.identifier.repourl	https://noesis.uis.edu.co
dc.identifier.uri	https://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/43756
dc.language.iso	spa
dc.publisher	Universidad Industrial de Santander
dc.publisher.faculty	Facultad de Ciencias
dc.publisher.program	Biología
dc.publisher.school	Escuela de Biología
dc.rights	info:eu-repo/semantics/embargoedAccess
dc.rights.accessrights	info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coar	http://purl.org/coar/access_right/c_f1cf
dc.rights.creativecommons	Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)
dc.rights.license	Attribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0)
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject	Pyrococcus furiosus
dc.subject	PfuS ADN polimerasa
dc.subject	expresión de proteína
dc.subject	Reacción en cadena de la polimerasa
dc.subject.keyword	Polymerase chain reaction
dc.subject.keyword	Protein expression
dc.subject.keyword	Fusion DNA polymerase
dc.title	Estandarización de un protocolo para la producción de la enzima PfuS ADN polimerasa
dc.title.english	Protocol standardization of Pyrococcus furiosus Fusion DNA polymerase PfuS production in-lab
dc.type.coar	http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f
dc.type.hasversion	http://purl.org/coar/version/c_b1a7d7d4d402bcce
dc.type.local	Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado