Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas
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Browsing Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas by browse.metadata.advisor "Arteaga, Herman Jose"
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Item Design of sirna sequences and in vitro evaluation against strategic targets of nef gene of human immunodeficiency virus type 1(Universidad Industrial de Santander, 2009) Alvarez Rozo, Lenis; Arteaga, Herman JoseRNA interferente (RNAi) es una función biológica conservada de silenciamiento genético mediada por oligonucleótidos pequeños de RNA interferente que destruyen de manera específica RNA mensajeros complementarios. RNAi actúa como un sistema antiviral, así como un sistema de regulación de la expresión genética. Diferentes genes del VIH-1 han sido eficientemente silenciados mediante siRNAs. Sin embargo, mutantes que escapan a este efecto son rápidamente inducidos. Proteínas esenciales para la replicación viral deben trabajar en un amplio rango de mutantes. En caso contrario, proteínas que confieren virulencia, pero no son esenciales para la replicación, cuando son blancos de siRNA podrían inducir la aparición de mutantes de baja virulencia que están bajo una presión selectiva menor. Blancos estratégicos, como secuencias que codifican para dominios altamente conservados y funcionales, pueden atenuar este fenómeno o producir cepas no viables de VIH-1. Nef es una proteína de virulencia, pero no es necesaria para la replicación. En este trabajo, cuatro blancos de siRNA fueron reconocidos para Nef en el tracto de polipurina, región de miristilación, motivo rico en prolinas y región de dimerización. Eficientes siRNAs contra estas regiones fueron identificadas de 11 secuencias de siRNA en forma de pinza (shRNA), las cuales fueron diseñadas manualmente, clonadas como shRNA en un plásmido Pol III y co-transfectadas en células HeLaT4 con un vector reportero que expresa la proteína de fusión Nef-dEGFP. Se identificaron shRNAs altamente eficientes contra la región rica en prolinas (2 secuencias con más del 95% de inhibición), la señal de miristilación (1 secuencia con 95% de inhibición), la región de dimerización (2 secuencias con 95% inhibición) y el Tracto de Polipurina (1 secuencia con 85% de inhibición). Por lo tanto, plásmidos que expresan shRNAs contra VIH-1 generados mediante este método pueden ser mejores candidatos para evitar la inducción de mutantes que escapan al efecto de RNA interferente.Item Evaluación del mecanismo de muerte celular inducido por una proteína de fusión recombinante generada a partir de los genes de las proteínas b13r y tk del virus del herpes simple, en líneas celulares tratadas con ganciclovir(Universidad Industrial de Santander, 2012) Betancourt Villamizar, Eddy Carolina; Arteaga, Herman Jose; Cardona, Maria EugeniaEn el área de la terapia génica antitumoral se han propuesto diferentes alternativas. El método GDEPT parece ser una alternativa bastante promisoria. Para la GDEPT se han explorado diversas combinaciones de enzimas y pro-fármacos. La combinación HSV/Tk y GCV, ha sido el sistema más investigado. En este sistema, la muerte celular es inducida por el GCV al ser fosforilado por HSV/TKk e inhibir la síntesis de DNA y desencadenar apoptosis. En los tratamientos antitumorales es deseable que la muerte celular se asocie a la inducción de una fuerte respuesta inmune antitumoral. Aunque Tk/GCV permite la ablación de un número considerable de células tumorales, la apoptósis es poco inmunogénica. Nosotros creemos que modificando el mecanismo de muerte celular en Tk/GCV se podría mejorar su inmunogenicidad y eficiencia. Hemos propuesto adicionar a este sistema, la proteína inhibidora de caspasas B13R y hemos diseñado y construído una proteína recombinante de fusión, constituida por B13R del VV, fusionada con Tk y GFP. La evaluación de Tk/GCV en presencia de B13R en células HEK-293T, mostró que, en este sistema, la muerte celular ocurre mediante un mecanismo diferente a la apoptosis, caracterizada por: diferencias morfológicas, baja actividad de caspasas, compromiso del potencial de membrana de membrana mitocondrial por disminución con respecto al proceso clásico de apoptosis, expresión de fosfatidil serina en la membrana y pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Considerando la función de B13R como inhibidor de caspasas y su efecto a estímulos apoptóticos irreversibles, es posible sugerir que este tipo de muerte celular pudiera ser una de las formas de necrosis programada. Este sistema pudiera utilizarse para estudios del efecto de las formas de muerte celular sobre el sistema inmune y especialmente, su respuesta ante las diferentes formas de muerte de células tumorales y su posible aplicación como método alternativo de GDEPT.Item Micro arn para el silenciamiento de genes del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1(Universidad Industrial de Santander, 2012) Pabón Martínez, Vladimir; Arteaga, Herman JoseARN de interferencia (ARNi) es un potente mecanismo de silenciamiento genético inducido por fragmentos de 21 pares de base denominados ARN interferentes pequeños (siARN). La utilización del mecanismo de liberación endógena de siARN mediado por micro ARN (miARN) puede lograr una mayor efectividad y superar las desventajas de otros métodos de liberación de siARN. En esta estrategia de liberación de siARN a partir de miARN se ha diseñado y evaluado experimentalmente en forma preliminar un modelo en el cual, miARN son generados desde un intron artificial insertado en el marco de lectura abierto del gen de resistencia a la Ouabaína, la cual funciona como un marcador de selección biológico. Para evaluar este modelo contra un blanco terapéutico relevante, se diseñaron miARN contra blancos del genoma del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1), y se compararon con shARN. La selección de células HeLa y 293T modificadas con estos constructos y resistentes a Ouabaína permitió comprobar el funcionamiento del mecanismo del splicing. Sin embargo, nuestro modelo no mostró el efecto de silenciamiento esperado contra ninguno de los dos blancos, probablemente por problemas en la liberación y procesamiento del miARN.